Type de document
Rapports de recherche scientifique
Année de publication
2015
Langue
Français
Résumé
Les bactéries du genre Legionella sont répandues dans plusieurs environnements tant naturels qu’artificiels. Les concentrations rencontrées dans les environnements naturels sont très faibles. Les phénomènes de contamination se rencontrent principalement dans les réservoirs artificiels où les températures de l’eau sont maintenues entre 25 et 42 °C, et où existe une certaine stagnation ainsi que la présence de dépôts, de biofilms et d’amibes. Les bains à remous, les piscines, les condensateurs d’évaporation, les brumisateurs et les tours de refroidissement sont reconnus comme étant des sources responsables de l’éclosion de légionellose en raison de la croissance importante des bactéries du genre Legionella dans ces milieux.
La bactérie du genre Legionella est responsable de deux maladies, la fièvre de Pontiac qui est une infection pulmonaire ressemblant à une grippe et la maladie du légionnaire qui est une pneumonie grave. Les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis ont rapporté plus de 6 800 cas de légionellose en 2009-2010 et la France a recensé 1 298 cas confirmés en 2012.
Un nouveau règlement modifiant le Code de sécurité intégrant des dispositions relatives à l’entretien d’une installation de tour de refroidissement à l’eau est entré en vigueur au Québec en juillet 2014. Ce règlement impose un suivi des concentrations de Legionella pneumophila dans l’eau des tours de refroidissement. Une tour de refroidissement ne doit pas contenir des concentrations en Legionella pneumophila considérées comme représentant un risque pour la population ou les travailleurs.
À la suite de l’éclosion de légionellose de l’été 2012 dans la ville de Québec, le directeur de la santé publique a émis des recommandations. Une de celles-ci consistait à mettre en place une méthode pour faire « l’identification rapide des sources lors d’une éclosion à partir de prélèvements et d’analyses par culture, q-PCR ou toutes autres méthodes à développer selon leur sensibilité et leur spécificité particulières ».
Cette étude a permis de valider trois systèmes moléculaires de détection et de quantification de la bactérie Legionella dans les échantillons d’eau. Les trois systèmes se sont révélés être très spécifiques pour effectuer cette analyse. Un premier système (JFP/JRP: LegLC) détecte l’ensemble des espèces du genre Legionella, un second (PT69-PT70: lpneuFL) est spécifique pour l’espèce Legionella pneumophila et le troisième (P66/P65: Sg1) est très spécifique pour les Legionella pneumophila appartenant au sérogroupe 1. En plus de pouvoir utiliser ces systèmes pour confirmer une identification lorsque la méthode par culture est employée, ils pourront être appliqués pour faire une analyse rapide et spécifique directement à partir des échantillons d’eau. La qualité de l’extrait d’ADN est très importante pour la réalisation de la polymérase en chaîne (PCR). Un ADN de qualité produit de meilleures quantifications en raison d’un plus grand contrôle des inhibiteurs. Du fait des risques d’inhibition de la PCR, il est essentiel d’inclure les contrôles nécessaires pour tous les échantillons. Les trousses d’extraction ont démontré des résultats très variables entre elles. Cette étape du processus analytique doit être contrôlée et suivie afin de produire des extraits de qualité pour la PCR.
Bien que cette approche de détection et de quantification par la PCR ne puisse remplacer, pour l’instant, la méthode par culture reconnue dans le règlement, elle est néanmoins en mesure, dans certaines situations critiques, de fournir des résultats beaucoup plus rapidement en plus de pouvoir produire des résultats d’analyse pour certains échantillons ayant une charge microbienne hétérotrophe élevée et ne pouvant être analysés par la méthode traditionnelle de culture, comme c’est le cas actuellement pour certaines industries québécoises. L’ensemble des contrôles incorporés au processus analytique permet de renforcer la confiance dans la robustesse des résultats, même pour ces échantillons qui ont une composition très complexe.
Bien que peu de corrélations aient été démontrées entre les résultats quantitatifs par PCR et ceux par culture, il est important de souligner que tous les échantillons positifs déterminés par la méthode de culture l’ont également été lorsqu’analysés par la méthode de la PCR. C’est-à-dire qu’aucun résultat faux négatif n’a été produit par nos systèmes. Ceci renforce son utilisation pour la confirmation de la non-contamination des systèmes de refroidissement industriels qui sont pratiquement impossibles à analyser par la méthode de culture.
Cette étude fournit une approche analytique permettant de caractériser à trois niveaux de spécification, soit au niveau du genre (Legionella spp), de l’espèce (Legionella pneumophila) et plus spécifiquement du sérogroupe 1 de cette espèce. Toutes les étapes de validation et d’optimisation ont permis d’identifier et de mettre en place un processus analytique fiable et robuste pour la détection de la bactérie dans la majorité des échantillons liquides.
Bacteria of the genus Legionella are widespread in many environments, both natural and artificial. The concentrations found in natural environments are very low. Contamination mainly occurs in artificial reservoirs with water temperatures ranging from 25 to 42 °C, where there is some stagnation along with the presence of deposits, biofilms and amoebae. Hot tubs, pools, evaporative condensers, misters and cooling towers are recognized sources of legionellosis outbreaks due to the substantial growth of bacteria of the genus Legionella in such environments.
Bacteria of the genus Legionella cause two diseases: Pontiac fever, an influenza-like respiratory infection, and Legionnaire’s disease, a severe pneumonia. The United States Centers for Disease Control and Prevention (CDC) reported more than 6,800 cases of legionellosis in 2009-2010 and France identified 1,298 confirmed cases in 2012.
In July 2014, a new regulation amending the Safety Code to include provisions on maintaining a water cooling tower installation came into force in Quebec. This regulation requires the monitoring of Legionella pneumophila concentrations in cooling tower water. A cooling tower must not contain Legionella pneumophila concentrations considered to represent a public or occupational risk.
Following the legionellosis outbreak in the summer of 2012 in Quebec City, the Director of Public Health issued recommendations, one of which was to implement a method for “rapidly identifying the sources in an outbreak using sampling and culture analysis, q-PCR or any other methods to be developed based on their sensitivity and particular specificity.”
This study validated three molecular systems for detecting and quantifying the Legionella bacterium in water samples. The three systems were shown to be very specific for purposes of this analysis. The first system (JFP/JRP: LegLC) detects all species of Legionella, the second (PT69-PT70: lpneuFL) is specific for the Legionella pneumophila species and the third (P66/P65: Sg1) is highly specific for Legionella pneumophila belonging to serogroup 1. In addition to being used to confirm identification by culture method, these systems can be applied to perform a rapid and specific analysis directly from water samples. The quality of the DNA extract is very important in the polymerase chain reaction (PCR). High quality DNA yields better quantifications due to greater control of inhibitors. Given the risk of PCR inhibition, it is essential to include the required controls for all samples. The extraction kits showed highly variable results. This step in the analytic process should be controlled and monitored in order to produce high quality extracts for PCR.
Although detection and quantification by PCR cannot yet replace the culture method recognized in the regulation, it can, in some critical situations, yield results much more quickly and produce analysis results for samples with an elevated heterotrophic microbial load that cannot be analyzed using the traditional culture method, as is currently the case in some Quebec industries. The set of controls incorporated into the analytical process increases confidence in the robustness of the results, even for these samples of very complex composition.
Although few correlations have been shown between quantitative PCR and culture results, it is important to note that all positive samples determined by culture method were also determined by PCR analysis, meaning that our systems yielded no false negatives. This favours its use in confirming the non-contamination of industrial cooling systems which are virtually impossible to analyze by culture method.
This study provides an analytical approach for characterizing three specification levels: genus (Legionella spp), species (Legionella pneumophila) and more specifically serogroup 1 of this species. The validation and optimization steps made it possible to identify and implement a reliable and robust analytical process for detecting the bacterium in most liquid samples.
ISBN
9782896318223
Mots-clés
Légionellose, Legionnaire's disease, Échantillonnage et analyse, Sampling and analysis, Dosage dans l'eau, Determination in water, Tour de refroidissement, Cooling tower, Réglementation, Regulation, Québec
Numéro de projet IRSST
0099-6430
Numéro de publication IRSST
R-887
Citation recommandée
Marchand, G. et Lacombe, N. (2015). Détection moléculaire des bactéries du genre Légionella dans l'eau des tours de refroidissement et l'eau de consommation (Rapport n° R-887). IRSST.